金樱子（RoselaevigataMichx），金樱及其究别名刺榆子、棕色金罂子、抗氧山石榴、化活金壶瓶、性研灯笼果等，金樱及其究为蔷薇科常绿攀缘植物，棕色主产于广东、抗氧广西、化活湖南、性研江西、金樱及其究浙江、棕色江苏、抗氧安徽等地，化活均为野生。性研成熟的金樱子含有多糖、黄酮类、三萜类及其衍生物等各种化学成分。其用途广泛，可用来酿酒、熬糖、加工饮料等。其提取物金樱子棕色素初步推断为黄酮类化合物，这类物质具有良好的抗氧化活性功能，可通过清除自由基达到抗氧化效果。本文以金樱子为原料，探索出一条提取金樱子棕色素的新的工艺路线，该路线简单易行，避免了使用毒性有机溶剂，可用于工业化生产。同时本文采用FRAP法和DPPH法，以维生素C和BHT为对比物，初步探讨了金樱子棕色素的抗氧活性的能力。采用荧光和化学发光法测定色素清除羟自由基和超氧阴离子自由基的能力，以及其抑制亚油酸脂质过氧化的作用，为提高金樱子棕色素的利用价值提供依据。

一、实验部分

1、实验材料

（1）实验原料与试剂

金樱子干果（购自当地药店）；FeCl₃、Fe-SO₄、HCI、维生素C、H₂O₂、苯甲酸、醋酸、醋酸钠、无水乙醇、95％乙醇、罗丹明B、三羟甲基氨基甲烷、二丁基羟基甲苯（BHT），以上试剂均为国产分析纯试剂；鲁米诺（1uminol，Merck公司）；邻苯三酚（Merck公司）；三吡啶三吖嗪（tripyridyhriazine，TPTZ，Sigma公司）；二苯基苦基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH，Sigma公司）。试验用水均为二重蒸馏水。

（2）实验仪器

UV-1700紫外-可见分光光度计、微弱化学发光仪（尤尼柯（上海）器有限公司）；CaryEclipse荧光分光光度计（美国瓦里安公司）；BS200s电子分析天平（上海天平仪器厂）；超滤膜（自制）；AB-8大孔吸附树脂（南开大学化工厂）；旋转蒸发仪RE52A（上海亚荣生化仪器厂）；DZF-6050型真空干燥箱（上海博迅实业有限公司）。

2、实验方法
（1）金樱子棕色素的提取工艺

金樱子→去杂→干燥→粉碎→石油醚脱脂→乙醇水溶液浸提→过滤→滤渣→二次浸提→滤渣
 

（2）FRAP法测定金樱子棕色素总抗氧化能力

FRAP法是基于氧化还原反应的比色法。在较低的pH条件下Fe³⁺三吡啶三吖嗪（TPTZ）可被试样中还原物质还原为Fe²⁺形式，呈现出蓝色，在波长593nm处具有最大光吸收，根据吸光度大小计算样品抗氧化活性的强弱。

分别配制0.1g／L的金樱子棕色素、BHT及维生素C溶液作为样品，FRAP工作液为10.0mmol／LTPTZ溶液、20.0mmol／LFeCl3溶液和0.3mmol／L醋酸钠缓冲液以1∶1∶10组成的混合物。用微量移液器分别精确吸取色素溶液、BHT溶液、维生素C溶液0.1mL，分别加入预热至37℃的1.80mLTPTZ工作液混匀，终反应液用各自溶剂补足至5.00mL，37℃反应10min，分别以各自溶剂为空白对照，测定593nm处的吸光度值（A），以1.00mmol／LFeSO₃为标准，样品抗氧化活性以达到同样吸光度所需的FeSO₄的毫摩尔数表示。

FeSO₄标准曲线的制备：精密移取0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mmoVLFeS0₄标准溶液各0.10mL分别置于5只微量试剂瓶中，分别加入预热至37℃的1.80mLFRAP工作液并用蒸馏水补足至5.0mL，混匀，37℃反应10min，以试剂做空白，在波长593nm处测定吸光度值，以吸光度值（A）为纵坐标，浓度为横坐标，计算回归方程。

（3）DPPH法测定金樱子棕色素抗氧化活性

DPPH是一种稳定的有机自由基，其乙醇溶液呈紫色，在可见光区最大吸收峰为517nm。当DPPH溶液中加入自由基清除剂时，溶液颜色变浅，A_517nm。值变小，而且吸光度变小的程度与自由基被清除的程度呈线性关系。因此可用自由基的清除情况来评价某物质的抗氧化能力，其抗氧化能力用清除率来表示，清除率越大，抗氧化能力越强。

先用无水乙醇配制2×10^-4mol／L的DPPH·溶液，同时分别称取一定量金樱子棕色素、BHT和维生素C用蒸馏水溶解，并将其稀释为以下浓度：0.01、0.02、0.03、0.04、0.059／L，作为测试液。用微量移液器精确吸取测定液2.0mL与DPPH溶液2.0mL混合，摇匀后放置30min，以无水乙醇为对照，测定波长517nm处的吸光度值AO同时测定2.0mLDPPH·溶液与2.0mL无水乙醇混合液的吸光度Ao，以及2.0mL测定液与2.0mL无水乙醇混合液的吸光度A₁，根据下列公式计算测定液对DPPH·的清除率。按以上测试方法分别测定其清除率，得出直线回归方程，进而计算其50％清除率（IC₅₀）。

清除率=[1一（A—A1）／Ao×100％

式中：A为加测试液后DPPH的吸光度；A₁为测定液在测定波长吸光度；Ao为未加测定液时DPPH的吸光度。

（4）金樱子棕色素清除超氧阴离子的能力

采用鲁米诺—邻苯三酚体系。邻苯三酚在碱性条件下能迅速的发生自氧化，产生一系列的有色产物。邻苯三酚与鲁米诺体系为快速发光，能在邻苯三酚自氧化速率呈线性的时间内达到发光峰值。色素中的抗氧化物质可以抑制超氧阴离子，降低其浓度，从而减弱发光强度。发光强度的降低值与色素中抗氧化物质清除O₂^-自由基的能力成正相关，因此，可以间接地测定色素对O₂^-自由基清除的能力。

在测定管中加入1.0mmoL／L鲁米诺（用0.1mol／L的碳酸钠溶液配成）2.OmL，加入不同量的色素（水乳浊液）溶液（或用同体积的双蒸水做空白），再注入20μL蒸馏水，最后加入10.0mmol／L邻苯三酚20μL起动反应，快速混匀，立即置入样品室中，在319.5nm波长处每间隔lmin测吸光值一次，共反应5min。每个样品平行做三次，取平均值，按下式计算清除率。

清除率=（CL₀-CL）／CL_o×100％

式中：CL₀为空白试验吸光度；CL为测试液吸光度。

（5）金樱子棕色素清除羟自由基的能力

采用罗丹明B-Fenton体系。Fenton反应是以过氧化氢为氧化剂，以亚铁盐为催化体系的氧化反应方法，在反应中可产生羟自由基（·OH）。罗丹明B是一种荧光染料，本身能产生特征荧光，其激发波长和发射波长分别为358nm和575nm。Fenton反应体系产生的·OH可以迅速氧化罗丹明B，使罗丹明B的荧光强度显著降低，从而间接测定羟自由基的产生量。

羟自由基检测：在测试管中依次加入Tris—HCL缓冲溶液（pH5.5）6.0mL，1.92×10^-3mmol／L罗丹明B溶液19.2uL，4.08mmol／LH₂0₂溶液0.48mL，0.64mmol／LFeS0₄溶液1.28mL，摇匀，反应5min后，用蒸馏水补足终体积至10.0mL。15min后在358nm激发波长下测定575nm处的荧光强度F，计算其与空白参比（罗丹明B与缓冲溶液）荧光强度F₀之差△F。

在上述体系中，加入不同浓度的色素水乳浊液，测定荧光强度Fs；未加Fenton试剂与色素的体系为空白体系，测定荧光强度F₀；则清除率按以下公式计算。

清除率=（F₀一Fs）／F0×100％

（6）金樱子棕色素抑制亚油酸脂质过氧化作用

Fe²⁺／亚油酸体系中，过渡金属离子如Fe²⁺等，可以通过多种途径促进脂质过氧化反应的进行。亚油酸是多不饱和脂肪酸，暴露在有氧环境中会发生自动氧化，实验时提高环境温度可以加速其氧化过程，通过测定其添加样品后的过氧化水平，并与空白对照比较，可以评价样品的抗脂质过氧化活性。

2mL样品溶液加入亚油酸乳浊液2.5mL，2.5mL磷酸盐缓冲液（0.2mol／L，pH7.0），0.1mL501xmol／L的氯化亚铁溶液，0.1mL50μmoL／L的维生素C溶液，37℃保温24h，每8h取0.1mL加入5mL75％乙醇，0.1mL30％的硫氰酸铵，0.1mL20mmol／L的氯化亚铁的3.5％HCL溶液（新鲜配制），室温下放置3min，磷酸盐缓冲液调零，以不加样品为空白，500nim下测定吸光度。抑制率计算公式：

抑制率（％）=（A_空白一A_样品）／A_空白×100

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